技術資料 - 甲基化敏感性 - Dam、Dcm 和 CpG 甲基化

Dam (GmATC), Dcm (CmCWGG) 和 CpG (mCG) 甲基化                 收藏

DNA 甲基轉移酶(MTases)普遍存在于原核和真核生物中,它能將 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到腺嘌呤或
胞嘧啶上。當使用限制性內切酶消化 DNA 時,要考慮 DNA 是否有甲基化的問題,因為如果識別序列中某個特
定堿基被甲基化后,切割就會被完全或者不完全阻斷。


原核生物甲基化

在原核生物中,DNA 甲基轉移酶作為限制修飾系統的一個組成部分廣泛存在,它們的作用是保護宿主菌不被相
應的限制性內切酶切割。大多數實驗室使用的大腸桿菌表達三種位點特異性的 DNA 甲基轉移酶。


• Dam 甲基轉移酶能將甲基轉移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位點上(1,2)。

• Dcm 甲基轉移酶能在 CCAGG 和 CCTGG(1,3)序列內部的胞嘧啶 C5 位置上甲基化。

• EcoKI 甲基轉移酶可將 AAC (N6A) GTGC 和 GCAC (N6A) GTT 上的腺嘌呤進行甲基化修飾。

 

如果限制性內切酶的切割對象是從表達 Dam 或 Dcm 甲基轉移酶的菌株中分離而得,并且其甲基化識別位點與
內切酶識別位點有重疊,那么該限制性內切酶的部分或全部酶切位點有可能被阻斷。例如,從 dam+ E. coli
分離的質粒 DNA 完全不能被識別序列為 GATC 的 MboI 所切割。


E. coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全甲基化(因此完全不能被 MboI 切
割),而 λDNA 只有大約 50% 的 Dam 位點被甲基化,這是因為在 λ DNA 被包裝到噬菌體頭部之前,甲基化酶
還沒來得及將 DNA 完全甲基化。因此,被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻斷的內切酶只能對這些 λ DNA 進行部
分切割。


被 Dam 或 Dcm 甲基化阻斷的限制性位點可以通過克隆方法去甲基化,即將 DNA 轉至 dam-/dcm-  菌株中進
行繁殖 [如 dam- /dcm- E. coli 感受態細胞(NEB #C2925)]。


如果出現重疊位點,內切酶酶切也會被阻斷。在這種情況下,Dam 或者 Dcm 序列一部分來自內切酶識別序
列,另一部分為識別序列左右旁側的序列。在設計內切酶酶切時也應考慮到這種情況。


真核生物甲基化

在高等真核生物(如 Dnmt1)中發現的 CpG 甲基轉移酶(CpG MTases),能將甲基基團轉移至胞嘧啶殘基
上的 C5 位點。CpG 甲基化形式受遺傳因素的影響,具有組織特異性,并與基因表達相關。因此,我們推測
CpG 甲基化在基因分化和表達中起了一定的作用(4)。


注意在消化真核基因組 DNA 時尤其要關注 CpG 甲基化的影響。需要注意的是,一旦 DNA 被克隆到細菌中
后,將不存在 CpG 甲基化形式。


甲基化敏感性

下表總結了NEB 限制性內切酶的甲基化敏感性,表中列出了內切酶識別位點被 Dam、Dcm或 CpG 甲基化后
內切酶的切割是否被阻斷或消弱。本表只對酶的特性提供參考信息,不能作為絕對依據。若想了解更多詳細信
息以及本指南所基于的特定例子,請登陸限制性內切酶 REBASE 數據庫
( http://rebase.neb.com/rebase/ )。 


參考文獻:

(1) Marinus, M.G. and Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol.,114, 1143–1150.

(2) Geier, G.E. and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem.,254, 1408–1413.

(3) May, M.S. and Hattman, S. (1975) J. Bacteriol.,123, 768–770.

(4) Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol., 7,r305–307.

 

 

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