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“疫”路艱辛,相伴同行 — 分子診斷篇

“疫”路艱辛,相伴同行 — 分子診斷篇
這個冬天真的不平凡,對于抗疫前線的醫護工作者和感染者來說,非常艱難!不過就像我們在最艱難的時候說的:冬天總會過去,春天即將到來。現在春天真的已經來了,武大的櫻花、上海的玉蘭、北京的迎春都已競相盛開。在全國醫護工作者、檢測和研究人員、社區和生活保障人員,以及所有居家隔離的大家共同努力下,每天的新增確診人數從四位數降到了一位數。然而,隨著全球疫情的爆發,大家仍不能松警惕,持續防護,共同守護這來之不易的抗疫成果。
 
在這春暖花開的大好時光,復工在即,學校開學也提上了日程,但仍有幾個詞仍在隱隱刺痛著我們:核酸檢測假陰性、超長潛伏期、無癥狀感染者、患者康復后轉陽。這些都意味著什么,有沒有辦法減少和避免呢?
 
核酸檢測假陰性:目前 qPCR 法核酸檢測為診斷新型冠狀病毒肺炎的“金標準”,但該方法檢測的檢出率并非 100%,據報道檢出率僅有 30~50%。因此核酸檢測結果為陰性,也不能完全排除新冠病毒感染的可能性。標本采集的質量、患者所處的病程及檢測試劑盒的質量等因素均可影響檢測結果。
超長潛伏期:2 月 9 日,預印本網站 medRxiv 上發表了一篇由鐘南山院士領銜的論文:《我國 2019 年新型冠狀病毒感染的臨床特征》。文章指出:根據 1099 例患者的樣本數據,潛伏期最短為 0 天,最長可達到 24 天,中位數據為 3 天。最長潛伏期 24 天大大超過了我們對于新冠病毒潛伏期為最長為 14 天的常規認知。
無癥狀感染者:新型冠狀病毒的無癥狀感染者,是指沒有明顯的臨床癥狀,如發熱、乏力、咳嗽等,但是病毒核酸檢測呈陽性的感染者。2 月 21 日,中國學者在《JAMA》上刊文,首次報告了國內無癥狀感染者的詳細情況。2020 年 3 月 20 日,國際頂尖學術期刊 Nature 發表了題為:Covert coronavirus infections could be seeding new outbreaks 的報告,指出 30%-60% 的新冠感染者無癥狀或者癥狀輕微,但他們傳播病毒的能力并不低,這些隱性感染者可能會引發新一輪的疫情大爆發。
患者康復后轉陽:通常意義上,檢測“陰性”意味著患者體內已基本沒有新冠病毒。但隨著新冠肺炎患者不斷出院,“復陽”事件也在各地隱現。公開資料顯示,湖北、四川、廣東、天津、江蘇、海南、陜西等地均有報告出院患者復陽。廣東省的初步統計數據顯示,出院患者中有 14% 存在“復陽”的現象。復陽原因尚未明確,可能與患者未完全康復和檢測假陰性有關。
 
我們看到,上述這四種情況均涉及到極低病毒滴度的檢測能力,這給新冠核酸檢測試劑盒提出了新的要求,靈敏度和穩定性變得愈加重要。檢測過程中每個步驟的試劑的質量都決定著極低拷貝量的檢出率。使用高品質的 RNA 提取試劑可減少樣品損失,高靈敏度的反轉錄試劑和 qPCR 試劑均可極大的減少核酸檢測假陰性的問題。
 
除此之外,更靈敏、更便捷的新新型核酸檢測方法也逐漸走向成熟,例如:等溫擴增法、Cas 蛋白切割法(Sherlock 法)等。
25 年來,New England Biolabs 一直致力于 PCR、qPCR 和相關擴增技術的開發創新,出色的產品性能與穩定質量讓我們在此次的抗疫過程中,贏得了諸多分子診斷廠商與病毒重點研究課題組的信賴和合作。NEB 始終恪守品質,可提供病毒核酸檢測的全套解決方案和原料試劑。
 
 
 
 
RNA 提取
 
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產品簡介:
  • 全能:集樣本保存、細胞裂解、gDNA 去除為一體
  • 廣泛適用:適用于培養細胞、血液、哺乳動物組織和病毒,及難裂解樣本,如細菌、酵母和植物。
  • 高質量:A260/280 和 A260/230 比值均≥1.8,高 RIN 值和極低 gDNA 殘留(gDNA 去除柱和 DNase I)。
  • 高效:可純化總 RNA 包含小 RNA,通過改變結合條件可以選擇性地篩選<200 nt 的 RNA,包含 miRNA、5S rRNA 和 tRNA。
  • 下游應用:提取純化得到的 RNA 可用于 RT-qPCR、cDNA 合成、RNA-seq等下游實驗。
 
該產品可用于:口腔拭子、唾液、鼻咽樣品(拭子、抽取物)。使用說明請見下面網頁鏈接:https://international.neb.com/protocols/2017/11/08/total-rna-purification-from-samples-stored-in-monarch-dna-rna-protection-reagent-using-the-monarch-total-rna-miniprep-kit-neb-t2010
 
RT-qPCR
 
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產品簡介:
  • 使用簡便:每個產品對應一種應用,方便的預混液形式及易操作的實驗步驟。新型 Luna Cell Ready 系列可免去核酸提取步驟,僅需 15 min 裂解步驟即可直接進行RT-qPCR
  • 性能優異:Luna 系列產品經過嚴格的優化及檢測以確保特異性、靈敏度、精確性及可重復性
  • 防污染:預混液中包含 dUTP,qPCR 前使用 NEB 的南極熱敏 UDG (NEB#M0372)或 UDG(NEB#M0280)進行預處理以防止產物殘留污染。
  • 避免加樣誤差:肉眼可見的藍色惰性示蹤染料,避免加樣失誤
  • 室溫建立體系:溫啟動的反轉錄酶和熱啟動 Taq 酶共同提升了反應特異性和穩定性
 
Taq 酶
 
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產品簡介:
NEB 提供的高質量的重組 Taq 酶,具有超高性價比。配套有不同的反應緩沖液,還具有熱啟動型、預混液型和 Quick-Load 型。熱啟動 Taq酶 配合熒光染料或熒光探針使用,可進行熒光定量PCR(qPCR)。
 
 
等溫擴增
 
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產品簡介:
等溫擴增即不需要改變反應溫度,即可進行目標片段擴增的方法。等溫擴增方案多種多樣,并各具優勢。NEB 提供品類齊全的等溫擴增系列產品,全面滿足等溫擴增檢測試劑盒的研發及生產。適用于等溫擴增的反轉錄酶為:WarmStart® RTx Reverse Transcriptase(見反轉錄列表)
 
NEB 公司在預印版 medRxiv 上發表的文章 Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP 顯示:使用 WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) 進行新冠狀病毒檢測的靈敏度高于市售 RT-qPCR 試劑盒。此外,Luna Cell Ready Lysis Module 也可用于 LAMP 檢測前的核酸提取。
 
 
反轉錄
 
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產品簡介:
針對 RNA 病毒檢測的反轉錄步驟,NEB 提供高靈敏度、適應不同溫度、以及更低起始量的一系列反轉錄酶及試劑盒。其中 ProtoScript® II 和 LunaScript™ RT 的檢測下限可低至 1 pg,非常適合用于極低量 RNA 病毒的反轉錄,可很大程度上提高檢測靈敏度。WarmStart® RTx 反轉錄酶適用于等溫擴增的反轉錄,其溫啟動特性可在室溫條件下建立體系,使用更方便。
 
 
體外轉錄
 
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產品簡介:
張峰團隊于 2019 年在Nature上發表了基于 Cas13 蛋白的核酸檢測方法(SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases),并在今年 2 月發布了基于該方法的新冠狀病毒診斷方案。近期,國內外學者也發表了基于 Cas12 和 Cas12a 核酸檢測方法的文章。這種新方法檢測靈敏度高、操作簡便,且均用到了 NEB 的體外轉錄試劑。
 
NEB 可提供一些列體外轉錄試劑盒和單酶,單次合成 RNA 的產量和完整度均高于其他品牌,部分產品可提供 GMP 級別試劑,且具有極高的性價比。
 
 
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相關文獻
1.      Presumed Asymptomatic Carrier Transmission of COVID-19
2.    Luo, Sihui et al. Confirmed asymptomatic carrier of SARS-CoV-2
3.    SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases
4.    A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics
5.    CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection
6.    Development and Evaluation of A CRISPR-based Diagnostic For 2019-novel Coronavirus
7.    An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12
8.    Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP
9.    Rapid colorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO
10. Development of Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assays Targeting SARS-CoV-2
11. Covert coronavirus infections could be seeding new outbreaks

 

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