切割錯配核酸內切酶 I                              收藏

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#M0678S
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產品特點

 

DNA 核酸內切酶
催化切割一些 DNA 錯配(T:T,G:G 和 G:T)
在兩條鏈上錯配堿基 5端的第三個磷酸二酯鍵處切割,切割后產生 5 bp 粘性末端,含 3'-OH 和 5'- 磷酸
對于 T 錯配切割效果最好;無法識別所有類型的 DNA 錯配
 

產品描述

切割錯配核酸內切酶 I 是一種依賴 Mg2+ 的 DNA 核酸內切酶,可特異切割錯配堿基對(T:T、G:G 和 T:G 錯配)。切割錯配核酸內切酶 I 在兩條鏈上錯配堿基 5端的第三個磷酸二酯鍵處切割,切割后產生 5 bp 粘性末端。切割錯配核酸內切酶 I 優先切割的 DNA 錯配為:T:T、G:G 和 T:G,也可輕松切割 T:I、G:I 和 G:U 錯配。此外,實驗證明:切割錯配核酸內切酶 I 在 T:C 類型的 DNA 錯配中可在含 T 的鏈上形成切刻。該酶還能切割 DNA:RNA 雜交鏈上的 T:G 和 T:U 錯配,但其切割效率低于 DNA:DNA 錯配。

 

圖 1.切割錯配核酸內切酶 I 能夠切割雙鏈 DNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 錯配

A)構建四個在同一位點包含特定突變質粒(p1-p4),使用差異磷酸化引物(正向或反向)擴增生成 8 個雙鏈 PCR 片段,長度約 672 bp ds1-ds8)。經 Monarch PCR & DNA 純化試劑盒(NEB #T1030)純化后,使用 5 units Lambda 核酸外切酶,經37℃孵育 60 分鐘,以特異性降解雙鏈片段中的磷酸化鏈(2.2 µg),從而產生一系列單鏈(正鏈/負鏈),同一位點堿基為 A/T/C/G。隨后使用 Monarch PCR & DNA 純化試劑盒(NEB #T1030)對這些單鏈片段(ss1-ss8)進行純化。

B)將純化后的含有 A/T/C/G 的單鏈片段進行混合,可形成精準配對的 DNA(綠色 √ 框)或含單堿基錯配的雙鏈片段(黃色 × 框)。為了生含錯配堿基的雙鏈,在下述條件下,選擇特定的正/反義鏈進行混合:在 1X NEBuffer 2.1 中重新退火,加熱至 95℃,再冷卻至室溫。上述實驗可產生 8 DNA 錯配(A:AA:CA:GC:CC:TG:GG:TT:T)。(C)如下方法檢測該酶切割 dsDNA 中特定錯配的能力:在 200 ng 含錯配的 dsDNA 中加入 80 units 切割錯配核酸內切酶 I37℃孵育 30 分鐘。后將產物進行瓊脂糖(1.2%)凝膠電泳并用溴化乙錠染色觀察。

 

圖 2.切割錯配核酸內切酶 I 能夠切割雙鏈 DNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 錯配 

 

使用前端帶有 FAM 熒光標記(藍色示蹤染料),末端帶有 ROX 熒光標記(紅色示蹤染料)的雙鏈 DNA 片段與80 units 切割錯配核酸內切酶 I(+M0678)在 NEBuffer r2.1 中,37℃孵育 30 分鐘,用于測定切割錯配核酸內切酶 I 切割 dsDNA 中特定錯配的能力。樣品經毛細管電泳分析顯示:酶解樣品(+M0678 樣品)與未經酶處理的樣品(-M0678)相比,T:T、G:T 和 G:G 錯配的底物峰發生偏移。此外,在 30 分鐘內即可看到 T:C 錯配中的含 T 鏈(藍色鏈)出現一些輕微切割。該酶在 T:C 錯配底物上的切刻活性隨著時間的推移而增加(最多 18 小時,本數據未顯示)。
 
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